Kỵ sĩ bóng đêm mở đầu bằng phân cảnh một băng nhóm tội phạm cướp ngân hàng thành phố Gotham của bọn mob (cách gọi khác của mafia). Băng cướp bị Joker âm mưu gài bẫy và giết hại lẫn nhau để nhận khoản tiền chia sẻ cao hơn, cho đến khi chỉ còn Joker sau khi hạ sát tên cuối cùng và tẩu thoát với toàn bộ số tiền. Batman (danh tính thật là Bruce Wayne), Công tố viên quận Harvey Dent và Trung úy Jim Gordon tạo thành một liên minh chống tội phạm có tổ chức của thành phố. Bruce tin rằng khi Dent trở thành người bảo vệ của Gotham, anh có thể từ bỏ thân phận Batman và có một cuộc sống bình thường với người bạn gái lâu năm là Rachel Dawes – dù cô và Dent đang hẹn hò.

Những ông trùm của bọn mob là Sal Maroni, Gambol và Chechen tổ chức một cuộc họp qua video với viên kế toán biến chất là Lau, sau khi y lấy khoản tiền của chúng và chạy trốn đến Hồng Kông để bảo vệ số tiền và tránh bị sờ gáy. Bất ngờ Joker xuất hiện chen ngang buổi họp để cảnh báo chúng rằng Batman đang ở ngoài vòng pháp luật, và đề xuất tiêu diệt Batman nhằm đổi lấy phần thưởng là một nửa khoản tiền của chúng. Các ông chủ của bọn mob không đồng ý, thậm chí Gambol còn treo một khoản tiền thưởng khác để lấy đầu Joker. Sau đó Joker tìm và thủ tiêu Gambol, chiếm lấy băng đảng của hắn. Cuối cùng bọn mob quyết định làm theo đề nghị của Joker. Trong khi đó Batman phát hiện Lau ở Hồng Kông và đem y trở về Gotham làm chứng, qua đó cho phép Dent bắt giữ toàn bộ bọn mob. Sau đó Joker đe dọa sẽ tiếp tục giết hại người vô tội trừ khi Batman tiết lộ danh tính thật; y khơi mào bằng cách sát hại Ủy viên Cảnh sát Gillian B. Loeb và bà thẩm phán chủ trì phiên xử án bọn mob. Sau đó Joker còn cố gắng ám sát Thị trưởng Gotham là ông Anthony Garcia nhưng Gordon đã hi sinh thân mình để bảo vệ ngài Thị trưởng. Rồi Dent bắt cóc một trong những tay sai của Joker và biết được Rachel là mục tiêu tiếp theo của y.

Bruce buộc phải đưa ra quyết định tiết lộ thân phận thật của mình để ngăn Joker không giết hại thêm sinh mạng nào nữa. Tuy nhiên trước khi anh kịp làm vậy thì Dent lại tuyên bố sai sự thật rằng mình là Batman. Rồi Dent bị áp giải vào buồng giam giữ bảo vệ trên xe vận tải nhưng Joker xuất hiện và tấn công đoàn hộ tống. Batman tiếp tục ra tay giải cứu Dent và Gordon (ông đã cải trang thành tài xế sau khi giả chết) và bắt giữ Joker, qua đó giúp Gordon được thăng chức lên Ủy viên. Các thám tử bị Maroni mua chuộc đã hộ tống Rachel và Dent đưa đi nhưng sau đó Gordon phát hiện ra họ chưa bao giờ về tới nhà. Trong khi đó Batman thẩm vấn Joker và được y tiết lộ rằng cả Rachel và Dent tại hai địa điểm riêng biệt có gắn kíp nổ, khiến Batman buộc phải lựa chọn cứu một trong hai người. Batman đua xe đến cứu Rachel, trong khi Gordon cố gắng cứu Dent. Nhưng khi đặt chân đến tòa nhà, Batman nhận ra anh đã bị Joker lừa đưa tên địa chỉ của Dent thay vì của Rachel. Cả hai tòa nhà phát nổ, giết chết Rachel và hủy hoại một nửa khuôn mặt của Dent. Cùng lúc đó Joker cũng tẩu thoát khỏi đồn cảnh sát cùng Lau và được y dẫn đến kho tiền của bọn mob. Sau đó Joker lấy xăng đốt trụi số tiền và giết luôn cả Lau lẫn Chechen.

Coleman Reese, một viên kế toán tại tập đoàn Wayne Enterprises suy luận ra Bruce là danh tính thật của Batman và đe dọa công khai thông tin trước công chúng. Vì không muốn lời tiết lộ của Reese can thiệp vào các kế hoạch của mình, Joker đe dọa sẽ phá hủy một bệnh viện trừ khi Reese bị thủ tiêu trong vòng một giờ đồng hồ. Tất cả các bệnh viện đều bị sơ tán và Gordon được cử đi bảo vệ Reese. Còn Joker trong bộ dạng cải trang một y tá phát hiện ra nơi Dent dưỡng thương và trao cho Dent một khẩu súng, qua đó thuyết phục anh đi trả thù cho cái chết của Rachel. Rồi Joker bấm kíp nổ phá hủy bệnh viện và tẩu thoát trên xe buýt kèm theo hàng loạt con tin. Trong khi đó Dent tiếp tục cuộc vui giết người, anh quyết định số phận của những kẻ mà anh cho là chịu trách nhiệm cho cái chết của Rachel bằng trò tung đồng xu may rủi. Cuối cùng Dent bắt cóc gia đình của Gordon vì tin rằng tình yêu Gordon dành cho gia đình ông cũng tương tự như tình yêu của anh dành cho Rachel.

Sau khi tuyên bố rằng thành phố Gotham sẽ phải chịu sự điều khiển của mình vào buổi tối, Joker đã gắn chất nổ vào hai chiếc phà sơ tán; một chiếc chứa dân thường còn chiếc kia chứa tù nhân. Các hành khách trên mỗi chiếc phà đều được trao một kíp nổ phá hủy chiếc phà kia, và Joker thông báo qua hệ thống liên lạc rằng y sẽ kích hoạt chất nổ ở cả hai phà nếu một trong hai phà chưa bị phá hủy trước nửa đêm. Bằng một thiết bị phát hiện tàu ngầm theo dõi toàn bộ thành phố, Batman đã phát hiện ra chỗ trốn của Joker với sự giúp đỡ miễn cưỡng của Lucius Fox. Cả dân thường và các tù nhân đều từ chối sát hại lẫn nhau, trong khi đó Batman tiếp cận và tóm được Joker sau một cuộc chiến chớp nhoáng. Trước khi cảnh sát đến để bắt giam Joker, y hả hê nói rằng người dân của Gotham sẽ đánh mất hi vọng một khi cơn thịnh nộ của Dent bị phơi bày trước công chúng.

Gordon và Batman đến tòa nhà nơi Rachel mất mạng. Lúc này Dent đang bắt gia đình của Gordon làm con tin và đe dọa giết họ. Anh bắn Batman, tự tha thứ cho mình rồi định giết con trai của Gordon vì cho rằng sự cẩu thả của ông đã khiến Rachel phải chết. Trước khi anh kịp tung đồng xu định đoạt số phận cậu bé, Batman trong bộ áo giáp đã ôm Dent nhảy khỏi tòa nhà và giết Dent. Sau đó Batman thuyết phục Gordon hãy để anh tự chịu trách nhiệm về những sinh mạng mà Harvey Dent đã giết nhằm bảo vệ hình tượng anh hùng của Dent. Khi cảnh sát tiến hành một cuộc săn tìm Batman, Gordon phá hủy thiết bị Bat-signal, Fox đứng nhìn thiết bị theo dõi tàu ngầm tự hủy, còn Alfred đốt cháy một bức thư từ Rachel nói rằng cô định cưới Dent. Phim kết thúc với cảnh Batman bị cảnh sát truy đuổi sau khi anh bị gán những tội ác mà Dent/Two-face gây ra.